サンプル
SNPsの探索には、２４人の日本人ボランティアより得たDNAサンプルを用います。各サンプルは３人分のDNAを混合して使用しています。ボランティアは適切なインフォームドコンセントを受けています。各人のサンプルからは個人情報は除かれ、個人情報と得られるデータとは非連結です。プロジェクトの実施にあたっては、研究倫理委員会を設置し、これらの事項を確認しています。
実験方法
- DNA領域の選択
このプロジェクトでは、特に遺伝子領域のSNPsを探索することを目的としているため、エクソン及びプロモーター領域を増幅領域としています。まずはじめに、GenBank DNA データベースより、エクソンやプロモーターの情報が付加されているヒトゲノム配列を、できる限り反復配列を含まない形で選択します。これらの情報がない配列については、エクソン予測プログラム（GENSCAN）、あるいはゲノム配列とmRNA/cDNA/Unigene配列とのホモロジー検索(BLAST Ver.2 と一部sim4の併用）により予測されたエクソン周辺領域を選択します。また、RefSeq(NCBI Reference Sequence Project) のcontig配列とmRNA配列との独自開発ソフトウエアの類似性検索から予測したエクソン周辺領域も選択します。
- プライマー設計
選択したエクソン、プロモーター、イントロン領域を増幅するため、PCRプライマ−を設計します。プライマ−の設計には、設計プログラム（Primer 3.0）を使用し、PCR産物の塩基長は0.6kbあるいは1.2から1.5kb になるように設計します。また、PCR産物の両鎖をシークエンスするために、インターナルプライマーも設計します。
- PCR産物の直接シークエンシング
PCR産物は、２本のＰＣＲプライマーと２本のインターナルプライマーを用い、通常の方法でシークエンスしています。ＰＣＲ産物を電気泳動した結果、薄い非特異的なバンドが認められた場合、ＰＣＲプライマーをそのまま用いるのではなく、それらの内側にシークエンス用のプライマーを新たに設計しています。反応液の調製などには、Biomek2000とMultimek96を使用し、泳動にはABI3700キャピラリーシークエンサーを使用しています。
- SNPs 探索
候補SNPsの検出には、検出プログラム(Polyphred）を使用します。各SNPの検証は、シークエンス結果を目で確認することにより行っています。
- SNPs 関連情報
SNPs 探索領域に関連するGenBank/EMBL/DDBJ登録情報、遺伝子名、染色体上の位置等の情報は、HOWDYより取得可能となっています。HOWDYとは、JSTのALISプロジェクトで開発されたヒトゲノム情報統合データベースです。
- SNPs マッピング
SNPsマッピングは、in silico(計算機ソフトウエア）手法により行います。
- 参考文献
SNPs 探索研究室情報
メンバーSamples
The SNPs are and will be developed from a pool of DNA samples
obtained from 24 unrelated Japanese volunteers. Each sample contains 3 individuals'
DNA.
All samples came from individuals who were provided informed
consent to be a part of this DNA polymorphism discovery resource. All
identifying and phenotypic information has been removed from the
individual samples so that links to individual donors are irreversibly
broken. We organized the ethics committee to discuss this issue and they
reviewed our research plan and recognized the anonymity of DNA samples
and adequate informed consent.
Experimental Methods
- Selection of DNA fragments
Since we decided to concentrate on finding SNPs within the genes, exons and promoter regions are the target segments for amplification. Human genomic sequences are retrieved from GenBank DNA database and entries containing information on exons and promoters are selected first. Without these data, exon prediction program (GENSCAN) is applied or homology search (BLAST Ver.2 partly with sim4) between mRNA/cDNA/Unigene records and genomic sequence records is carried out to find (possible) exons. We also predict exons by comparing mRNA records with the genomic contig records in the NCBI Reference Sequence Project (RefSeq) using our original computer software. Repeat regions are masked by RepeatMasker with options of "Do not mask simple repeats and low complexity DNA".
- Primer pick-up
PCR primers are selected to amplify extracted exons, promoter regions, and introns. Computer program (Primer 3.0) is used and the size of PCR product is 0.6 kb or 1.2 to 1.5 kb. Internal primers are also selected for sequencing both strands of the products.
- Direct sequencing of PCR products
PCR products are sequenced with the set of two PCR primers and two internal primers according to the manufacturer's recommendation. When the PCR product contains faint non-specific fragment(s) judged from electrophoresis, two additional internal primers rather than PCR primers themselves are used for sequencing. Biomek2000 and Multimek96 are used for liquid handling and ABI3700 capillary-based sequencers are for electrophoresis.
- SNP detection
Computer program (Polyphred) is used to indicate possible SNP loci. For verification, inspection of each candidate SNPs are carried out by human's eye.
- SNP related Information
Detailed information on the screened regions, i.e. GenBank/EMBL/DDBJ accession numbers, gene names and chromosomal locations, can be obtained from HOWDY, a human genome database developed by JST ALIS Project.
- SNP Mapping
We are mapping SNPs by in silico techniques.
- Reference
SNPs Identification Lab Information
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